同种带瓣主动脉去内皮和去细胞处理后生物学特性及免疫原性的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (33): 5249-5256.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.001

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同种带瓣主动脉去内皮和去细胞处理后生物学特性及免疫原性的变化

荆辉^1，2，常青²

¹青岛大学，山东省青岛市 266071；²青岛大学附属医院心血管外科，山东省青岛市 266003

出版日期:2014-08-13 发布日期:2014-08-13
通讯作者: 常青，博士，副主任医师，青岛大学附属医院心血管外科，山东省青岛市 266003
作者简介:荆辉，男，1992年生，山东省临清市人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事心脏同种异体瓣膜移植后钙化防治研究。
基金资助:
山东省高等学校科技计划(J12LL09)，课题名称：HGF基因转染促进同种瓣移植后体内再内皮化的研究

Alteration of biological and immunological properties of aortic homografts after de-endothelialization and decellularization

Jing Hui ^{1, 2}, Chang Qing²

¹ Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China; ² Department of Cardiovascular Surgery, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Online:2014-08-13 Published:2014-08-13
Contact: Chang Qing, M.D., Associate chief physician, Department of Cardiovascular Surgery, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Jing Hui, Studying for master’s degree, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China; Department of Cardiovascular Surgery, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Supported by:
Higher Education Science and Technology Project of Shandong Province, No. J12LL09

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前同种瓣已在临床广泛应用，但移植后远期易发生衰败和钙化。
目的：探究同种带瓣主动脉经去内皮和去细胞处理后，生物学特性和免疫原性的变化，寻找更好的同种瓣去细胞处理方法。
方法：取家兔带瓣主动脉根部，随机分为新鲜组、去内皮组、去全部细胞组。分别采用苏木精-伊红、Masson、VG染色进行组织形态学观察；生物学特性评价组织厚度、抗张强度、断裂拉伸率、热皱缩温度；通过免疫组织化学染色观察及原子火焰吸收法测定移植物钙含量变化进行免疫原性评价。
结果与结论：组织形态学观察发现去内皮和去细胞方案均达到了对应的去细胞目的。与新鲜组相比，去内皮组抗张力性能变化不明显(P > 0.05)，去细胞组显著下降(P < 0.01)。异体移植实验后苏木精-伊红染色观察发现：新鲜组炎性反应最为显著，组织中有大量炎细胞浸润；与新鲜组相比，去内皮组炎性反应明显减轻，炎性细胞数目明显减少，去细胞组炎性反应最轻，仅组织边缘有炎性细胞浸润。免疫组织化学发现：去内皮组和去细胞组CD152表达水平明显高于新鲜组(P < 0.05)。钙含量分析发现：去内皮组和去细胞组钙盐含量较新鲜组显著下降(P < 0.05)。提示去内皮和去细胞同种带瓣主动脉的免疫原性均显著下降，而去内皮处理能更好地保留同种瓣的抗张性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 心脏瓣膜, 同种移植, 去细胞, 去内皮, 免疫原性, 生物学特性, 家兔

Abstract:

BACKGROUND: Aortic root homograft has been widely used, but it still has a high incidence of calcification and degeneration after operation.
OBJECTIVE: To investigate the alteration of biological and immunological properties of rabbit aortic root homograft treated with de-endothelialization and decellularization methods, and to find a better decellularization method.
METHODS: Aortic root homografts obtained from rabbits were randomly divided into fresh group, de-endothelialization group, and decellularization group. The morphology of homografts was evaluated by hematoxylin-eosin, Masson and VG stainings. The biological properties such as thickness, tensile strength, broken extension rate, and heat shrinkage temperature were detected. The immunological features (inflammatory cell infiltration, calcium content and CD152 expression) were determined with immunohistochemistry and flame atomic absorption spectrometry.
RESULTS AND CONCLUSION: As demonstrated in morphological observation, protocols of de-endothelialization and decellularization methods we used attained our desired aim of decellularization perfectly. Tensile strength and broken extension rate of decellularization group were decreased significantly compared with fresh group (P < 0.01), while the difference between de-endothelialization group and fresh group was not significant (P > 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that, inflammatory reaction was the most apparent in fresh group, showing a large amount of inflammatory cells infiltration; compared with fresh group, inflammatory reaction was significantly attenuated in de-endothelialization group, the number of inflammatory cells was significantly decreased. The inflammatory reaction was the lowest in the decellularization group, only inflammatory cells infiltrated the tissue edge. Immunohistochemistry showed that, CD152 expression was significantly increased in de-endothelialization and decellularization groups compared with fresh group (P < 0.05). Calcium content in de-endothelialization and decellularization groups was significantly decreased compared with fresh group (P < 0.05). It could be concluded that the immunogenicity of de-endothelialized and decellularized aortic homografts is decreased significantly, and the de-endothelialization method could better maintain the tensile property.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: valve, transplantation, homologous, transplantation immunology

中图分类号:

R318

荆辉，常青. 同种带瓣主动脉去内皮和去细胞处理后生物学特性及免疫原性的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5249-5256.

Jing Hui, Chang Qing. Alteration of biological and immunological properties of aortic homografts after de-endothelialization and decellularization[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5249-5256.

图/表（结果） 7

2.1 光镜、电镜观察结果见图1-3。

新鲜组：样本组织大致结构完整，表面被一层完整的内皮细胞覆盖，平滑肌层无损伤。内皮细胞呈典型的鹅卵石样，纤维结构排列致密、规则，呈典型的波浪状，纤维之间可见大量细胞成分。

去内皮组：样本组织表面未发现内皮细胞，可见暴露的平滑肌细胞、成纤维细胞和粗大的纤维，纤维结构排列致密、规则，深层纤维仍呈波浪状，未发现明显的断裂。

去细胞组：样本内细胞成分几乎完全消失，仅能观察到纤维网状支架，弹力纤维、胶原纤维的三维网状结构尚完整，呈轻微波浪状，但排列较疏松、紊乱。

2.2 生物学特性评价结果见表1。

2.2.1 组织厚度新鲜组和去内皮组样品组织厚度差异无显著性意义(P > 0.05)，去细胞组样品厚度高于新鲜组和去内皮组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2.2 抗张强度和断裂拉伸率与新鲜组相比，去内皮组样本的抗张强度和断裂拉伸率差异无显著性意义(P > 0.05)。与新鲜组和去内皮组相比，去细胞组样本的的抗张强度和断裂拉伸率明显降低(P < 0.05)。

2.2.3 组织热皱缩温度与新鲜组相比，去内皮组组织的热皱缩温度差异无显著性意义(P > 0.05)。与新鲜组和去内皮组相比，去细胞组样本的热皱缩温度轻度下降，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 免疫学特性评价结果

2.3.1 苏木精-伊红染色光镜观察结果 3组组织切片中均有程度不等的炎细胞浸润，以淋巴细胞浸润为主。其中：新鲜组炎性反应最为显著，组织中有大量炎性细胞浸润；与新鲜组相比，去内皮组炎性反应明显减轻，炎性细胞数目明显减少；去细胞组炎性反应最轻，仅组织边缘有炎性细胞浸润。去内皮组与去细胞组差异不明显(图4)。

2.3.2 移植物钙含量测定结果异体移植前，3组带瓣主动脉的钙含量差异无显著性意义(P > 0.05)；异体移植后，组间差异变大。新鲜组的移植物钙含量显著增加，明显高于去内皮组和去细胞组的钙含量增长值(P < 0.05)。去内皮细胞组和去细胞组钙盐增长值差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.3.3 CD152免疫组织化学观察结果经观察，新鲜组的大多数切片以浅褐色染色为主，且阳性细胞数目< 25%，

CD152表达量最低。去内皮组与去细胞组的大多数切片以深褐色染色为主，阳性细胞数目> 75%，CD152表达量显著高于新鲜组，差异有显著性意义(P < 0.05)，但去内皮组与去细胞组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

参考文献

[1]Musci M, Weng Y, Hübler M, et al.Homograft aortic root replacement in native or prosthetic active infective endocarditis: twenty-year single-center experience. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2010;139 (3):665-673.
[2]王盛宇,薛金熔,赵铁夫,等.同种主动脉瓣在心脏外科的应用[J].中国心血管病研究杂志, 2010,8(1):7-9.
[3]Kilian E, Fries F, Kowert A, et al.Homograft implantation for aortic valve replacement since 15 years: results and follow-up, Heart. Surg Forum. 2010;13(4):238-242.
[4]Vohra HA, Whistance RN, Chia AX, et al.Long-term follow-up after primary complete repair of common arterial trunk with homograft: a 40-year experience. Thorac Cardiovasc Surg. 2010;140(2):325-329.
[5]da Costa FD, Costa AC, Prestes R,et al.The early and midterm function of decellularized aortic valve allografts. The Annals of thoracic surgery.2010;90(6):1854-1860.
[6]Kitamura S, Yagihara T, Kobayashi J, et al. Mid-to long-term outcomes of cardiovascular tissue replacements utilizing homografts harvested and stored at Japanese institutional tissue banks. Surgery today.2011;41(4):500-509.
[7]Park S, Hwang HY, Kim KH,et al.Midterm Follow-up after Cryopreserved Homograft Replacement in the Aortic Position. Korean J Thorac Cardiovasc Surg. 2012;45(1):30-34.
[8]常青,李守先, 徐平,等.同种异体大鼠的主动脉移植后影响移植物钙化的因素分析[J].细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(1): 106-109.
[9]Kitamura S, Yagihara T, Kobayashi J, et al. Mid-to long-term outcomes of cardiovascular tissue replacements utilizing homografts harvested and stored at Japanese institutional tissue banks. Surgery today.2011;41(4): 500-509.
[10]Muratov R, Britikov D, Sachkov A, et al.New approach to reduce allograft tissue immunogenicity. Experimental data. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2010;10(3):408-412.
[11]Yu BT, Li WT, Song BQ, et al. Comparative study of the Triton X-100-sodium deoxycholate method and detergent-enzymatic digestion method for decellularization of porcine aortic valves.Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2013; 17(16):2179-2184.
[12]Dohmen PM.Tissue engineered aortic valve. HSR proceedings in intensive care & cardiovascular anesthesia. 2012;4(2):89.
[13]Moccia F, Tanzi F, Munaron L. Endothelial Remodelling and Intracellular Calcium Machinery. Curr Mol Med. 2014;14(4): 457-480..
[14]赵金超,易定华,魏旭峰,等.环氧氯丙烷对戊二醛鞣制的猪主动脉瓣防钙化化学改性的实验研究[J].中国实用医药, 2008,3(6): 1-3.
[15]Chang Q, Jing H, Sun M, et al. Exploring the role of short-course cyclosporin a therapy in preventing homograft valve calcification after transplantation. Cellular immunology. 2014;287(1): 36-45.
[16]den Hamer I, Hepkema B, Prop J, et al.Hla antibodies specific for cryopreserved heart valve ‘‘homografts’’ in children. Thorac Cardiovasc Surg. 1997;113 (2):417-419.
[17]Hoekstra F, Knoop C, Vaessen L, et al.Donor-specific cellular immune response against human cardiac valve allografts. Thorac Cardiovasc Surg.1996;112(2):281-286.
[18]Muratov R, Britikov D, Sachkov A, et al.New approach to reduce allograft tissue immunogenicity. Experimental data, Interact. Cardiovasc. Thorac Surg. 2010;10(3):408-412.
[19]Kneib C, von Glehn CQ, Costa FD, et al.Evaluation of humoral immune response to donor HLA after implantation of cellularized versus decellularized human heart valve allografts, Tissue Antigens.2012;80(2):165-174.
[20]Lehr EJ, Rayat GR, Chiu B, et al.Decellularization reduces immunogenicity of sheep pulmonary artery vascular patches. Thorac Cardiovasc Surg. 2011;141(4):1056-1062.
[21]Brockbank KG, Song YC.Mechanisms of bioprosthetic heart valve calcification1. Transplantation. 2003;75(8): 1133-1135.
[22]Taflin C, Charron D, Glotz D, et al.Immunological function of the endothelial cell within the setting of organ transplantation. Immunol Lett. 2011;139(1):1-6.
[23]Post IC, Weenink RP, van Wijk AC, et al.Characterization and quantification of porcine circulating endothelial cells. Xenotransplantation.2013;20(1):18-26.
[24]Wallbrecht K, Drick N, Hund AC, et al.Downregulation of endothelial adhesion molecules by dimethylfumarate, but not monomethylfumarate, and impairment of dynamic lymphocyte-endothelial cell interactions. Exp Dermatol. 2011; 20(12):980-985.
[25]Ferrero MC, Bregante J, Delpino M, et al.Proinflammatory response of human endothelial cells to Brucella infection, Microbes Infect. 2011;13(10):852-861.
[26]Kaveh M, Chayjan RA. Prediction of some physical and drying properties of terebinth fruit (pistacia atlantica l.) using artificial neural networks.Acta Sci Pol Technol Aliment.2014; 13(1):65-78.
[27]巩性军,李守先,庞昕焱,等.同种带瓣主动脉移植后影响供体组织钙含量的相关性研究[J].中华实验外科杂志, 2009,26(3): 339-341.
[28]Zou W.Regulatory T cells,tumour immunity and immunotherapy.Nat Rev Immunol. 2006;6(4):295-307.
[29]Schweizer MT, Drake CG.Immunotherapy for prostate cancer: recent developments and future challenges.Cancer Metastasis Rev. 2014 Jan 30. [Epub ahead of print].
[30]Kloog Y, Mor A. Cytotoxic-T-Lymphocyte Antigen 4 Receptor Signaling for Lymphocyte Adhesion Is Mediated by C3G and Rap1.Mol Cell Biol. 2014 ;34(6):978-988.

引言

同种心脏瓣膜及其带瓣管道因血流动力学效果良好、抗感染性强、血栓栓塞发生率低等特性，被广泛地应用于瓣膜置换及矫治复杂先天性心脏病的手术中，取得了良好的临床效果^[1-4]。但是移植后远期易发生损毁、钙化，导致部分患者需要二次手术。研究表明：同种带瓣主动脉组织中的细胞成分有较强的免疫性，尤其是内皮细胞，移植后早期即可激发受体免疫排斥反应，这与瓣膜远期的损毁、钙化有显著性的相关性^[5-7]。寻找减轻同种心脏瓣膜免疫原性，同时又能保证其结构与功能稳定性的最佳处理方法，是心血管外科研究的热点^[8-10]。目前大多数研究者认为，在瓣膜移植之前应将同种主动脉根部中的细胞成分全部除去，只保留完整的纤维支架，这样才能最大程度地减弱患者移植后的免疫排斥反应，延长使用寿命^[11]。

虽然，组织中供体细胞成分有较强的免疫原性，但是这些成分对于维持同种主动脉根部的结构完整性与功能稳定性至关重要，将之完全除去，必然会对同种主动脉根部造成一定程度的损伤^[12]。若仅脱去免疫原性最强的内皮细胞，是否可以既降低免疫原性，又最大程度保留组织的结构完整性^[13]？

为明确综合效果更好的处理方案，实验采用简洁、有效的方法，对家兔主动脉根部进行去内皮细胞和去全部细胞处理，从不同角度探讨新鲜同种主动脉根部经去内皮和去细胞处理后，组织形态学、生物学特性和免疫原性的变化，全面评价两种处理方式，现将结果报告如下。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年9月至2014年3月在青岛大学医学院病原微生物实验室和青岛大学医学院动物房完成。

材料：

实验动物：同种带瓣主动脉供体选用成年健康近交系中国家兔(雌雄不限)，体质量2.0-2.5 kg；异体移植实验受体选用健康近交系成年新西兰大白兔(雌雄不限)，质量2.0-2.5 kg，均购自青岛大学医学院实验动物中心。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

试剂：Ⅰ型胶原酶、胰酶、DNA酶、RNA酶均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

实验方法：

同种带瓣主动脉的获取及处理：供体中国家兔麻醉后仰卧固定，胸前备皮、消毒，前正中切口进胸，暴露心脏。仔细游离升主动脉和心脏周围大血管，结扎并离断，完整取出心脏。自心尖部将心脏剪开，小心剪除主动脉周围脂肪组织，保留主动脉根部、瓣叶及瓣下心肌，修剪过程注意保持湿润。

将带瓣主动脉随机分为3组：新鲜组、去内皮组和去细胞组。①新鲜组：不做特殊处理，作为对照。②去内皮组：在带瓣管道的主动脉弓分叉端用4-0丝线结扎，另一端置入留置针后用丝线结扎固定。通过留置针向管道内注入0.25%的Ⅰ型胶原酶至充盈，浸入37 ℃恒温无菌生理盐水中，消化30 min，重复3次。用生理盐水反复冲洗后备用。③去细胞组：将带瓣主动脉浸入50 mL含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS中，置于37 ℃恒温培养箱中24 h，每12 h换液1次。血清终止胰酶消化，PBS冲洗后移入50 mL 1% TritonX-100溶液中，4 ℃，48 h。再次PBS冲洗后，置入含20 mg/L RNaseⅠ和200 mg/L DNase Ⅰ的PBS溶液中，37 ℃，1 h。PBS反复冲洗后备用。

组织形态学观察：

光镜观察：取样后用体积分数10%中性甲醛固定，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，3.0 μm切片，分别行苏木精-伊红染色、Masson染色和VG染色后光镜观察。苏木精-伊红染色观察瓣叶及管壁组织结构及细胞成分的变化；Masson染色、VG染色分别观察组织中胶原纤维和弹性纤维的排列、变化。

扫描电镜观察：3%戊二醛固定，1%饿酸固定，丙酮逐级脱水，醋酸异戊脂置换，临界点干燥，铂、钯合金离子喷涂，扫描电镜观察同种主动脉去内皮和去细胞处理后组织结构变化。

生物学特性评价：

测量组织厚度：分别用HD-l0台式厚度仪(中国，上海)测量3组的样本厚度(精确度0.01 mm)。测量前后用中性滤纸吸干组织表面的残余水分。

抗张力测试：横向和径向修剪标本(平均径向长度 15.0 mm，平均横向宽度5.0 mm)，测量每个标本的厚度，共3次，取其平均值。将标本沿径向固定于拉伸机(Instron 4302，德国)上，使用100 N的力传感器，载荷范围定为 20.0 N，样本的夹持间距为8.0 mm，以2.0 mm/min的速度拉伸，直到标本破坏。

测量组织的热皱缩温度：将样本修剪为约3.0 mm× 4.0 mm大小，置入差示扫描量热仪(德国)中，密封加热，起始温度定为30 ℃，升高5 ℃/min，终末温度为100 ℃。以吸热峰作为样本的热收缩温度。

免疫原性评价：

异体移植实验：无菌条件将瓣膜修剪成0.5 cm×0.5 cm大小。受体新西兰兔麻醉后俯卧位固定，腹部备皮，消毒铺巾。正中切口进腹，分离腹膜，游离肾动脉下方腹主动脉至髂动脉分叉处。阻断血流后，纵行切开腹主动脉前壁，将同种移植物以8-0缝线三定点连续缝合于腹主动脉前壁切口处。重新开放血管后，触摸远端动脉波动良好，术后苏醒且次日无下肢瘫痪作为手术成功的标准。腹内留置少量庆大霉素，逐层缝合切口。术后密切观察受体动物存活情况，8周后处死动物，完整取出移植物。

苏木精-伊红染色光镜观察：取样后同上制备切片，苏木精-伊红染色后光镜观察各组切片中，宿主炎性细胞的浸润情况。

钙含量测定：异体移植实验前、后分别取样，去离子水清洗，滤纸吸干水分，采用原子火焰吸收法定量测定移植物的钙含量^[14]。

移植物CD152免疫组织化学观察：取样后戊二醛固定，切片，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封固，镜下观察。以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每例均随机观察12个高倍视野，结果判断采用二级计分法。

阳性细胞数目：<5%为0分，5%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，> 75%为4分。染色强度分类：浅褐色为1分，褐色为2分，深褐色为3分。

将细胞阳性率与染色强度两者积分相乘：0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-8分为中度阳性(++)，9-12分为强阳性(+++)。

主要观察指标：与新鲜组相比，同种瓣经去细胞和去内皮处理后，物理性能和免疫原性的变化。

统计学分析：所得数据采用SPSS 19.0软件包进行统计学处理。计量资料所得结果以x(_)±s表示，显著性检验采用析因设计资料的方差分析F 检验，组间均数两两比较的t 检验。定性资料所得结果进行等级资料的秩和检验。检验水准α=0.05，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

如今，在发达国家和发展中国家，心脏瓣膜疾病是最常见的心血管病变之一，同种带瓣大血管移植术为根治瓣膜疾病提供了新的思路^[1-4]。相比于机械瓣和其他生物瓣，同种带瓣大血管有许多不可比拟的优点，比如卓越的血流动力学功能，抗感染能力强，较低的血栓形成率，术后无需常规抗凝，手术方式较为简单等。在过去的几十年内，主动脉根部替换术已在临床广泛开展^[3-4]。虽然同种带瓣主动脉移植后，近期和中期效果令人鼓舞，但是，组织的远期钙化和衰败一直困扰着心脏外科医师^[15-17]。随着研究的发展，许多学者发现同种瓣有一定程度的免疫原性，移植后可以诱发宿主的免疫排斥反应，而免疫排斥反应又是同种瓣远期钙化和衰败的主要诱因^[18-21]。移植前的去细胞处理为减弱同种瓣的免疫原性，解决移植后的衰败和钙化问题提供了一条新的思路。

目前，关于同种瓣的去细胞处理，大多数研究者认为：理想的同种瓣组织应当尽可能包含较少的免疫原性成分(如供体细胞、脂质膜、胞膜相关抗原、核酸、可溶性蛋白等)，组织中所有供体成分均应被去除，主要由细胞外基质组成的无细胞支架才是最理想的瓣膜替代物^[12]。但这种去细胞方式对同种瓣的组织结构完整性和机械强度造成的损伤不可忽视^[11]。

同种瓣组织中内皮细胞的主要功能是为间质细胞和细胞外基质提供保护屏障，调节平滑肌细胞的生长，抑制钙盐沉积和血栓形成。但是，Nuala Mooney等证实：内皮细胞也是同种瓣组织中抗原性最强的细胞成分，同种瓣移植后的免疫排斥反应主要由组织中的供体内皮细胞诱发^[22]。内皮细胞表面表达的CD54和CD62E可以介导宿主外周血中的单核细胞黏附并攻击同种瓣组织，这对于免疫反应的发生有至关重要的作用^[23-25]。

既然同种瓣的细胞成分中，内皮细胞的免疫原性最强，如单纯去掉内皮细胞，同种瓣整体的免疫原性也应大幅下降，同时保留了较为完整的细胞外基质，利于促进胶原的合成和组织的重塑，对同种瓣组织生物学性能的破坏程度也远低于前一种去细胞处理^[13]。

为明确合理的同种瓣处理方法，本研究采用最简洁、有效的方法，构建去全部细胞和去内皮的同种瓣，全面评价处理后生物学特性和免疫原性的变化。

胶原酶和酶-去垢剂-核酸酶被用来构建去内皮和去细胞同种瓣，Ι型胶原酶能够消化结缔组织中的胶原，去除内皮细胞而不影响同种瓣组织中的其他细胞成分。胰酶能通过水解细胞间的连接蛋白去除细胞，Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，能够溶解细胞表面的蛋白和磷脂分子，核酸酶能够分解细胞破碎后释放的核酸碎片。

组织形态学观察表明：胶原酶消化法去除了同种瓣组织中的内皮细胞成分，成纤维细胞和纤维网状结构完整保留；胰酶-Triton X100-核酸酶法完全去除了组织中的细胞成分，同时保留了完整的细胞外基质，弹力纤维、胶原纤维的三维网状结构完整保存。

生物学特性评估结果表明：去细胞组的组织厚度比新鲜组轻度增高，表明去细胞处理在除去细胞成分的同时也除去了疏水性脂质，导致水分在亲水性的纤维网络中积聚，组织稍有水肿。热皱缩温度可反应胶原纤维的交联度，热皱缩温度越高，胶原纤维的交联度越高，热稳定性好^[26]。3组样本的热皱缩温度没有显著性差异，表明去内皮和去细胞处理均未明显影响纤维的排列和交联程度。

但是，生物力学结果提示：新鲜组和去内皮组样本的抗张强度和断裂拉伸率没有显著差异(P > 0.05)，这表明去内皮处理后，细胞外基质的天然三维结构得到良好的保留。去细胞组样本的抗张强度和断裂拉伸率与另两组相比显著下降(P < 0.05)，说明去细胞处理在一定程度上破坏了同种瓣的抗张力性能。

移植后的苏木精-伊红染色观察结果提示：新鲜组样本的炎症反应最强，与之相比，去内皮组和去细胞组明显减轻，两组之间没有显著差异。

作者之前的研究发现：移植物中的钙含量与移植后的免疫排斥反应有密切关系^[8]。巩性军等^[27]通过一系列动物实验进一步证明：移植物内的钙含量与移植后的免疫反应水平正相关。因此，作者在本实验中选择钙含量作为评价免疫排斥反应强度的指标之一。钙含量测定结果提示：去内皮组和去细胞组样本中的钙含量增长值显著低于新鲜组样本的钙含量增长值(P < 0.05)，但是，去内皮组和去细胞组钙含量增长值之间差异无显著性意义 (P > 0.05)。

CD152，又名CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4)，是一种相对分子质量为36 000-37 000的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族^[28-29]。CD152和CD28高度同源，它们有共同的配体B7。但CD152与B7的结合力是CD28与B7结合力的20倍。CD152分子的胞内结构域包含ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)，在于TCR结合后，能够产生负性调节细胞免疫的作用。因此，CD152的在胞膜上的表达量与对细胞免疫的抑制作用成正相关关系^[30]。结果中，去细胞组的CD152表达量最高，其次是去内皮组，但是去内皮组与去细胞组之间没有统计学差异(P > 0.05)，去内皮组与去细胞组均显著高于新鲜组 (P < 0.05)。

综合以上结果可以合理地得出结论：去内皮处理和去细胞处理均能大幅减弱同种瓣的免疫原性，处理后，两种同种瓣的免疫原性大致相当。但是，与去内皮处理相比，去细胞处理对同种瓣的机械性能造成了一定程度的破坏。此外，去内皮处理比去细胞处理更简单易行。去内皮处理比去细胞处理更适于同种瓣，能够被用来抑制移植后免疫排斥反应，延长同种瓣的使用寿命。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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同种带瓣主动脉去内皮和去细胞处理后生物学特性及免疫原性的变化

Alteration of biological and immunological properties of aortic homografts after de-endothelialization and decellularization

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[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[4]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[5]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[6]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[7]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[8]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[9]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[10]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[11]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[12]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[13]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[14]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[15]	刘畅, 李大同, 刘元, 孔令擘, 郭瑞, 杨利学, 郝定均, 贺宝荣. 急性症状性骨质疏松性胸腰椎压缩骨折椎体强化手术后疗效欠佳：与骨水泥、骨密度、邻近骨折的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3510-3516.